液相色譜-串聯質譜法測定牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代謝物殘留量

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

15.2.1.1 適用范圍

適用于牛、豬肌肉和肝臟中卡巴氧及其代謝物脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和喹乙醇代謝物3-甲基喹噁啉-2-羧酸殘留量的液相色譜-串聯質譜測定。方法檢出限：卡巴氧、脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸均為0.5ug/kg。

15.2.1.2 方法原理

用乙腈+乙酸乙酯(1+1，v/v)溶液提取肌肉和肝臟組織中的卡巴氧，提取液經正己烷脫脂后，旋轉蒸發至干，殘渣用甲酸(0.1%)+甲醇(19+1，v/v)溶液溶解。樣液供液相色譜-串聯質譜儀測定，內標法定量。用甲酸溶液消化試樣，使組織中天然存在的酶失活，然后加入蛋白酶水解，鹽酸酸化，離心過濾后，過Oasis MAX固相萃取柱或相當者凈化。先用二氯甲烷洗脫脫氧卡巴氧，再用2%甲酸乙酸乙酯溶液洗脫喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸，氮氣吹干洗脫液，殘渣用甲酸+甲醇(19+1，v/v)溶液溶解，樣液供液相色譜-串聯質譜儀測定，內標法定量。

15.2.1.3 試劑和材料

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純；正已烷、乙酸、濃鹽酸、乙酸鈉、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯：分析純；中性氧化鋁：200～300目：乙腈+乙酸乙酯溶液：(1+1，v/v)。

甲酸乙酸乙酯溶液：2%。向400mL乙酸乙酯中加入10mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500mL；甲酸溶液：0.6%。量取6.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L；甲酸溶液：0.1%。量取1.0mL甲酸，用水溶解、定容至1L；甲酸+甲醇溶液：(19+1，v/v)。用190mL甲酸溶液與10mL甲醇混合；鹽酸溶液：0.1mol/L。量取8.3mL濃鹽酸，用水溶解、定容至1L；鹽酸溶液：0.3mol/L。量取25mL濃鹽酸，用水溶解、定容至1L；Protease蛋白酶：Sigma P5147 或相當者，-18℃以下保存；蛋白酶水溶液：0.01g/mL。稱取1.00g Protease蛋白酶，用水溶解、定容至100mL，4℃保存；乙酸溶液：10%。量取100mL甲酸，用水溶解、定容至1L；乙酸鈉溶液：0.05mol/L，pH=7。稱取6.8g乙酸鈉用800mL水溶解，再滴加10%乙酸溶液以調節溶液pH=7，用水定容至1L；乙酸鈉+甲醇溶液：(19+1，v/v)。用190mL乙酸鈉溶液與10mL甲醇混合；甲醇+水溶液：(1+4，v/v)；Tris堿：Sigma T1503或相當者；Tris溶液：1.0mol/L。稱取121 g Tris堿，用水溶解、定容至1L，4℃保存?？ò脱?、脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸、喹噁啉-2-羧酸-d4標準物質：純度≥99%。

標準儲備溶液：100mg/L。準確稱取適量標準物質，卡巴氧用二甲基甲酰胺溶解定容，其余標準物質分別用甲醇溶解定容，配成100mg/L的標準儲備液，在-18℃保存，可使用1年。

基質混合標準工作溶液：根據靈敏度和使用需要，用空白樣品提取液配成不同濃度(μg/L)的基質混合標準工作溶液，在4℃保存，可使用1周。

內標工作溶液：準確稱取適量內標標準物質，用甲醇溶解定容，配成100μg/L的標準工作溶液，在4℃保存，可使用1周。

陰離子交換柱： Oasis MAX 60mg，3mL，或相當者。用前分別用3mL甲醇和3mL水活化，保持柱體濕潤。

15.2.1.4 儀器和設備

液相色譜-串聯質譜儀：配有電噴霧離子源；固相萃取裝置；氮氣濃縮儀；液體混勻器；分析天平：感量0.1mg和0.01g；真空泵；均質器；移液器：10～100uL和100～1000uL；聚丙烯離心管：50mL，具塞；pH計：測量精度±0.02pH單位；低溫離心機：可制冷到4℃；玻璃離心管：15mL。

15.2.1.5 樣品前處理

(1)試樣制備

將牛、豬肝臟和肌肉組織樣品充分攪碎，均質，分出0.5kg作為試樣，置于清潔樣品容器中，密封，并做上標記。將制備好的試樣于-18℃以下保存。

(2)卡巴氧的前處理步驟

稱取5g試樣，精確至0.01g。置于50mL聚丙烯離心管中，加入5g中性氧化鋁。加入25mL乙腈+乙酸乙酯溶液，于液體混勻器上充分混合5min，以5000r/min離心5min，將上清液移取至另一干凈的50mL離心管，加入10mL正已烷到管內，振蕩2min，以5000r/min離心5min，棄去上層正已烷，將下層清液轉移至150mL雞心瓶中。

重復上述步驟一次， 合并2次提取液于同一雞心瓶中，加入一定量的喹噁啉-2羧酸-d4標準溶液，使其濃度為2.0ng/g，40℃水浴，減壓旋轉蒸發至干。準確加入1.0mL甲酸+甲醇溶液溶解殘渣，過0.2um濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

(3)脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸的前處理步驟

稱取5g試樣，精確至0.01g。置于50mL聚丙烯離心管中，加入10mL 0.6%甲酸溶液，混勻后，置于47℃±3℃振蕩水浴中振搖1h；先加入3mL 1.0mol/L Tris溶液混勻，再加入0.3mL蛋白酶溶液，充分混勻后，置于47℃±3℃振蕩水浴中酶解16~18h。加入20mL 0.3mol/L HCI，振蕩5min，在10℃以5000r/min離心15 min，上清液過濾。 將濾液移入Oasis MAX固相萃取柱中，待樣液全部流出后，用30mL乙酸鈉+甲醇溶液淋洗固相萃取柱，真空抽干15 min。在- - 支干凈的玻璃管內加入一定量的喹噁啉-2羧酸-d4標準溶液，使其濃度為2.0ngg，再用4×3mL二氯甲烷將脫氧卡巴氧洗脫至管內，在45℃用氮氣濃縮儀吹干。固相萃取柱再用3×3mL甲醇、3mL水、3×3mL 0.1mol/L鹽酸和2×3mL甲醇+水溶液溶液分別淋洗，真空抽干15min，然后用2mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，棄去全部淋出液，最后用3mL甲酸+乙酸乙酯溶液洗脫喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸至試管中，在45℃用氮氣濃縮儀吹干。準確加入1.0mL 0.1%甲酸+甲醇溶液溶解殘渣，過0.2um濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

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