牛、豬肝臟和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代謝物殘留量測定分析方法的選擇

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

15.2.1.7 分析方法的選擇

(1)樣品處理方法

1)卡巴氧原形藥的提取方法

卡巴氧在水和丙酮等極性溶劑中溶解性差，文獻中通常選擇甲醇-水溶液作為組織提取液，溶液中不可避免地含有大量水溶性蛋白和色素等雜質，這些雜質成分復雜并帶有顏色，使提取液混濁，嚴重影響定性與定量效果，同時污染色譜柱。在選擇提取液的試驗中，試驗發現甲醇-水溶液對卡巴氧提取效果不如乙腈，為此，本研究分別使用乙酸乙酯、乙腈以及二者混合液進行樣品提取，試驗數據表明，以乙腈作為提取液回收率普遍較低，只有40%~50%；而采用乙酸乙酯-乙腈(1+1)混合溶劑的提取效果最佳，既能達到滿意的回收率，又能減少弱極性雜質的干擾。為此，本研究采用乙酸乙酯-乙腈(1+1)混合溶劑為提取液，在提取前加入中性氧化鋁于樣品中，提取過程用正己烷脫脂，以減少脂肪的干擾。提取溶液經減壓旋轉蒸發至干，定容，LC-MS/MS檢測。

2) 代謝產物DCBX、QCA和MQCA的提取方法

DCBX、QCA和MQCA等代謝物在動物體內與蛋白質以結合態存在，通常可采用酸水解、堿水解或酶解的方式將目標化合物與蛋白組織分離，其中酶解的效果最好，不僅反應條件最溫和，且與動物組織分離最為徹底。文獻報道溫度和pH值對酶的生物活性影響極大，本實驗方法選用Protease蛋白酶進行酶解，Protease在pH8.5、溫度47℃時活性最強。酶解之前，先在樣品中加0.6%的甲酸溶液，置于47℃空氣浴中1h，使動物組織中天然存在的酶失活；然后用Tris緩沖溶液調節pH，加入Protease蛋白酶，置于47℃空氣浴中過夜(16～18h)。

在樣品溶液中加入0.3mol/L HCI，使酶解液酸化后，采用陰離子交換固相萃取柱進行凈化，本研究對比了Bond Elute Certify II 和Oasis MAX兩種商用SPE柱的效果，結果表明Oasis MAX的凈化效果和回收率優于前者，本研究對固相萃取所用溶液、流速控制、淋洗和被測物的洗脫等條件進行優化，根據化合物性質，DCBX、QCA和MQCA需要分兩步洗脫，第一步用二氯甲烷洗脫DCBX，第二步用含2%甲酸的乙酸乙酯洗脫QCA和MQCA。

(2)液相色譜條件

1)色譜柱的選擇

比較了Phenomenex Luna C18、Waters Atlantis dC18以及Inertsil ODS-3等不同填料色譜柱的分離效果，結果表明，使用Inertsil ODS-33um，2.1×100mm色譜柱時，各化合物的出峰時間、分離度和峰形較好。

2)流動相的選擇

質譜采用正離子模式進行檢測時，通常使用有一定酸度的流動相，以使被分析物容易質子化帶上正電荷，從而提高檢測的靈敏度，本實驗比較了0.05%～0.3%的甲酸溶液，結果表明，使用0.1%的甲酸溶液作為流動相各組分得到比較好的分離，并且質譜上有較強的響應，故實驗選擇0.1%的甲酸溶液作為流動相。另外，流動相體系還包括甲醇和乙腈，采用梯度洗脫，柱溫30℃，進樣量30 μL。

(3)質譜條件

動物組織的成分復雜，樣品基質容易對目標分析物產生干擾，本研究采用電噴霧離子源(ESI)和正離子掃描方式進行LC-MS/MS檢測，多反應監測模式(MRM)能有效的消除樣品基質的干擾，大大提高方法的靈敏度。為了消除樣品基質對離子化的抑制作用，在標準溶液和測試樣品溶液中都加入已知量的內標QCA-d4。選取豐度最強的離子作為各組分的監測離子，通過對質譜條件進行優化，使每種化合物的分子離子與特征碎片離子的例子對強度達到最大，四種化合物選定的質譜條件為：離子源溫度： 450℃； NEB： 8.00； CUR： 7.00； CAD： 5.00； IS： 5000.00； EP： 10.00。

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