硝基呋喃類代謝物最大允許殘留分析技術——測定方法（三）

時間：2023-03-25 05:38:39來源：food欄目：食品快速檢測閱讀：

硝基呋喃類代謝物最大允許殘留分析技術——測定方法（三）

[db:作者] / 2022-12-12 00:00

(4)免疫分析法(immunoanalysis，IA)

免疫學分析方法是基于抗原-抗體特異性反應建立起來的測定方法，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強等諸多優點，缺點是假陽性率較高。

1)酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

Cooper等首先應用AOZ的衍生物CPAOZ連接HAS制備完全免疫抗原，并成功得到敏感性高、特異性強的多克隆抗體，對除AOZ以外的NFs代謝物和其他化合物幾乎不存在交叉反應。IC50值為0.065μg/L，可檢測出樣品中的AOZ的濃度為0.3μg/kg，為呋喃唑酮代謝物的免疫分析方法奠定了基礎。隨后，Cooper等又建立了蝦組織中AOZ的ELISA分析方法，方法檢測限為0.1μg/kg，批內和批間RSD分別為18.8%和38.2%。Cheng等建立了魚中AOZ的ELISA檢測方法。通過得到敏感性和特異性較好的多克隆抗體，對樣品中經衍生化反應后的NPAOZ進行檢測。兔多抗由免疫抗原(2-NP-HXA-AOZ)免疫產生，AOZ的IC50為0.14μg/kg，檢測限為0.025μg/kg，遠遠低于歐盟所要求的1μg/kg。應用此方法，檢測了370份實際魚肉樣品，以AOZ的濃度為0.3μg/kg作為判定界限，此ELISA方法的敏感性為100%，與HPLC相比(0.3μg/kg)特異性為98.5%，并沒有出現假陰性結果。Diblikova等應用ELISA方法檢測動物組織中AOZ的殘留量。對于蝦肉、禽肉、牛肉、豬肉的無假陽性檢測濃度水平為0.4μg/kg，在蝦肉中添加濃度水平為0～32.1μg/kg的范圍內，ELISA與LC-MS/MS方法的相關性為0.999，而在禽肉中添加濃度水平為0～10.5μg/kg的范圍內，兩種方法的相關性也很好。沈美芳等的研究表明，運用ELISA法測定水產品中AOZ殘留時，稀釋倍數對回收率影響顯著，乙酸乙酯提取次數、光照條件和放置時間對測定結果無顯著影響。用該方法對魚、蝦、蟹進行加標回收率試驗，0.60～6.00μg/kg加標水平的回收率為87%～11.8%，CV為1.76%～12.57%。

蔣宏偉應用ELISA技術，用針對兔IgG的羊抗體包被微量反應板，對蜂蜜、豬肉、牛肉、蛋粉、奶粉、牛尿等動物產品中的AOZ、AMOZ進行了檢測。作者認為該ELISA法采用了AOZ或AMOZ特異性抗體，精確度、靈敏度均較高，具有經濟、操作簡便、檢測時間短等優點，適合于大量動物產品樣本中呋喃唑酮、呋喃它酮殘留量檢測的快速篩選。Pimpitak等建立了蝦肉中AMOZ的ELISA方法。該方法獲得了針對AMOZ的兩種高特異性單克隆抗體，其中一種僅僅針對呋喃它酮和AMOZ產生高特異性結合，不與其他化合物發生交叉反應。競爭ELISA方法中其IC50針對AMOZ和呋喃它酮分別為5.33ng/mL、1.33ng/mL，檢測限可以達到0.16μg/kg。

王欽暉等采用間接競爭ELISA方法測定了豬肉中呋喃妥因代謝物AHD。在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物AHD經衍生化后和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗呋喃妥因代謝物的衍生物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AHD代謝物的含量成負相關，與標準曲線比較即得出樣本中呋喃妥因代謝物的殘留量。

Vass等應用分子模擬研究抗原的合成，獲得呋喃西林代謝物SEM的多克隆抗體，并建立直接競爭ELISA方法。得到的SEM多抗IC50為0.06～2.28μg/L，線性范圍為0.01～0.2ug/L。在0.5～20ug/kg范圍內，方法的回收率在82%～105%之間，CV小于15.5%。在沒有假陰性結果的前提下，肌肉中方法的靈敏度可達到0.3μg/kg。Cooper等建立了雞肉中SEM的ELISA方法，與呋喃西林的交叉反應率為1.7%，在一定范圍內與其他呋喃類藥物幾乎不存在交叉反應。方法CCβ為0.25μg/kg，此方法同時也可用于雞蛋和雞肝樣品中SEM的檢測。

2)膠體金免疫層析法(immune colloidal gold technique，GICT)

潘心紅等用小牛血清蛋白(BSA)偶聯的AMOZ免疫小鼠，制得雜交瘤細胞，得到純化好的抗AMOZ單克隆抗體，并制得膠體金試紙條。用膠體金試紙半定量法直接測定魚肉中呋喃它酮代謝物AMOZ的含量。結果表明，與AOZ、AHD無交叉反應，檢測靈敏度可達2.5μg/kg，回收率在80%～91%之間，相關性良好。該方法測定的結果與HPLC法相符，無顯著性差異。

3)熒光免疫分析法(fluoroimmunoassay，FIA)

沈玉棟等首次建立了呋喃西林代謝物SEM的熒光偏振免疫分析(FPIA)方法。通過設計合成新的SEM半抗原CEPSEM，偶聯載體蛋白后免疫新西蘭大白兔，制備親和力高、特異性好的多克隆抗體。在示蹤物濃度為0.5nmol/L，抗體稀釋度為1/100的優化條件下，IC50為47.9μg/L，檢出限為8.3ug/L，線性范圍為15.8～145.7μg/L。該方法特異性強，和其他相關善藥交叉反應小于0.1%，穩定性好，批內RSD小于2.5%，批間RSD小于6.3%。

4)免疫傳感器(immunosensor)

Yang等在傳統的無標記電化學阻抗滴定免疫傳感器的基礎上，建立了一種快速可靠的電化學方法檢測AOZ。AOZ單克隆抗體(AOZ-McAb)通過EDC和NHS所產生的穩定的?；被ブ虚g體在金電極.上包被，它可冷凝自組裝單層(SAM)上的抗體。通過電化學阻抗譜(E1S)測量AOZ和AOZ-McAb免疫反應前后的電荷轉移電阻的相對變化而實現對AOZ的檢測。在優化條件下，電荷轉移電阻的相對變化與AOZ濃度的對數值成比例，在20.0～1.0×104ng/mL(r-0.9987)之間。同時，這個免疫傳感器對AOZ具有很高的選擇性，對AMOZ、SEM和AHD沒有顯著反應。在實際樣品的AOZ檢測中具有良好的效果。

5)生物芯片(biochip)

OMahony等將基于化學發光生物芯片陣列感測技術應用到蜂蜜中NFs殘留篩查。通過這種復合技術，4種NFs代謝物可以被同時檢測。分別針對各代謝物的特異性抗體被點到生物芯片上，競爭性分析通過化學發光反應展開。該方法按照歐盟法規2002/657/EC的規定進行了驗證。采用相似的提取方法，即用OasisSPE提取，再用2-NBA衍生化，乙酸乙酯萃取，與UPLC-MS/MS方法進行了比較。該生物芯片陣列感測技術可以檢測執行限濃度(1μg/kg)下的4種代謝物，AHD、AOZ和AMOZ的檢測能力低于0.5μg/kg，SEM低于0.9μg/kg，IC50從0.14μg/kg(AMOZ)到2.19μg/kg(SEM)。這種生物芯片技術在食品安全研究領域具有很好的應用前景。

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