牛豬肝腎和肌肉組織中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留測定分析條件的選擇

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.1.7 分析條件的選擇

(1)被測物的提取

本方法試驗了用乙酸乙酯和叔丁基甲基醚(MTBE)進行提取，其結果見表9-5。由表9-5可見，乙醚和MTBE提取玉米赤霉醇和玉米赤霉酮的效率相當，而對于二苯乙烯類激素則MTBE作為提取溶劑回收率較好，因而最終選取MTBE作為提取溶劑。

表9-5 不同溶劑提取對回收率的影響

動物源性樣品中玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素以兩種形式存在，即游離態和與蛋白結合態，加入β-葡糖苷酸酶可使結合態的玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素水解成游離態。本實驗在基質中添加結合了單葡萄糖醛酸的己烯雌酚標準物質，模擬比較酶解前后己烯雌酚的回收率，結果表明酶解后回收率提高30%以上，因而在實際樣品測定中酶解是必不可少的步驟。本方法采用兩步提取:先用MTBE提取樣品中游離態的組分，轉移出MTBE后，將樣品殘渣中殘余MTBE除凈，將乙酸鹽緩沖液中加入殘渣后，加入酶解劑水解，中和后用MTBE抽提，這樣可保證游離態的和與蛋白結合態的玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素都能有效提取。

(2)固相萃取凈化

LC-MS/MS具有較高的檢測靈敏度，但復雜的基質背景會抑制目標化合物的離子化效率，大大降低被測組分的檢測靈敏度，而且樣品凈化程度對結果重現性也有很大的影響。本方法采用硅膠柱進行SPE凈化處理，比較了不同牌號的硅膠柱，發現美國J.T.Baker公司Bakerbond SPE Sillica Gel(SiOH) Column (500mg)回收率相對較高，因而最終選擇用Bakerbond SPE硅膠柱。

本方法檢測的5種類雌激素及代謝物要求限量低，基質復雜，因此考慮應用自動固相萃取儀(AS PE)減少人為因素誤差，提高重現性。對淋洗液比例、洗脫液比例、洗脫液用量各項參數進行優化,結果見表9-6至表9-8。

表9-6 淋洗液比例對回收率的影響(淋洗液用量6mL)

表9-7 洗脫液比例對回收率的影響(先用乙酸乙酯-正己烷[6+94]淋洗，再行洗脫)

表 9-8 洗脫液用量對回收率的影響(分三次洗脫，每次用量3mL)

實驗檢測的目標物為兩類，玉米赤霉醇及代謝物和二苯乙烯類激素。兩類物質性質上存在差別，因而在確定最終實驗條件時需兼顧兩類物質。由表9-7可見，淋洗液比例只能選用乙酸乙酯-正已烷(6+94，v/v)，6mL。由表9-8實驗結果得出，應用乙酸乙酯-正己烷(60+40，v/v)洗脫液可得到全部目標物較高的回收率。由表9-9實驗結果得出，應用6mL洗脫液能將待測物洗脫約90%，再增加洗脫液用量回收率沒有明顯提高，但吹干時間將延長。最終確定了本實驗淋洗液比例、洗脫液比例、洗脫液用量各項參數。

(3) 質譜條件的優化

采用注射泵直接進樣方式，以5μL/min將玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚的標準溶液分別注入串聯質譜的離子源中。一級質譜分析(Q1，母離子掃描)比較了電噴霧電離(ESI)的正方式和負方式，5種被測物均在負方式條件下得到了較高的響應值，確定了準分子離子峰[M-1]，優化了去簇電壓(DP)。對被測物的準分子離子碰撞后，進行二級質譜分析(MS2，子離子掃描)，得到子離子質譜圖，見圖9-3。

圖9-3 五種化合物二級質譜圖

對每種被測物選定的子離子進行碰撞氣能量(CE)的優化。在連接了液相色譜儀后，嘗試采用大氣壓化學電離(APCI)負方式進行測定，發現APCI(-)電離方式檢測靈敏度更高些。通過對APCI(-)條件下離子源溫度、霧化氣壓力、氣簾氣壓力、輔助氣1壓力、噴霧器電流等參數優化，確定了本方法最終分析參數。以優化后本方法提供的參數對被測物進行檢測，玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚的方法最低檢出限可達0.25μg/kg，己烯雌酚和雙烯雌酚的方法檢出限為0.5μg/kg，可滿足日常檢測和殘留監控要求。

(4)HPLC條件的優化

本方法先后試用了Waters公司、Agilent公司、Merck公司等多個品牌的C18和C8柱，經比較Agilent公司的ZORBAX SB C8(150mm×4.6mm，3.5μm)對玉米赤霉醇和二苯乙烯類激素的分析柱效更好一些。

采用APCI電離時，乙腈為首選流動相，流速1mL/min。在此前提下試驗了不同流動相比例和梯度程序。由于流速較高，乙腈比例不宜低，最終選定乙腈-水=70+30。對比了不同梯度洗脫程序的分離結果，沒有明顯改善，因而選定了固定比例流動相。

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